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为了确定局部照射对肿瘤生长和mdscs的影响，当肿瘤直径达到7.5 mm时，我们使用大分割rt(20 gy/f)治疗皮下llc肿瘤。放疗导致肿瘤进展延迟长达一周，在第7至第10天的最小体积约为500mm 3，但此后肿瘤开始再生。根据放疗前后肿瘤生长曲线，我们选择放疗后第3天为再生前生长，放疗后1周为肿瘤体积最小时为再生开始，放疗后2周和3周为再生阶段。肿瘤组织苏木精-伊红染色显示，与未治疗的肿瘤相比，放疗后的肿瘤中有更多的浸润性炎症细胞。随后的cd11b特异性免疫组化染色显示，大多数炎症细胞是cd11b+髓系细胞，这表明局部照射可能导致mdscs的积累。为了证实我们的假设，我们在局部照射后的不同时间点对总mdscs和这两个亚群进行了流式细胞术分析。局部照射后，放疗后肿瘤浸润mdscs的比例比未治疗肿瘤高2倍(ctrlvs. rt=21.33±3.29% vs. 44.10±3.00%，p<0.001)。pmn-mdscs与总mdscs具有相同的增加趋势(ctrlvs. rt=16.37±2.47% vs. 38.66±4.24%，p<0.001)，而m-mdsc比例保持在约0.1%，且与肿瘤大小和治疗无关。外周血情况同肿瘤组织。
为了确定受照射肿瘤中pmn-mdsc 的逐渐积累是否有助于llc 肿瘤的再生长，或者这种积累是否仅仅是肿瘤生长的结果，使用抗ly-6g 单克隆抗体来消耗mdsc .抗ly-6g抗体的应用显着降低了肿瘤部位和外周血中pmn-mdsc的频率（p<0.05）。此外，用抗 ly-6g 抗体治疗大大延迟了照射后的再生，这表明pmn-mdsc的募集对肿瘤再生至关重要。
虽然pmn-mdscs利用一系列机制来抑制抗肿瘤免疫反应，这涉及到许多免疫细胞和细胞因子，但对cd8+t细胞的抑制无疑是最重要的。为了确定rt 后 pmn-mdscs 诱导的免疫抑制是否依赖于cd8 + t 细胞，我们通过流式细胞术评估了cd8 + t 细胞的数量和功能。
如图3d 所示，cd8 + t 细胞的百分比随着照射从11.71± 2.31%下降到2.42 ±0.62%(p<0.01)。pmn-mdsc耗竭逆转了这种下降（rtvs. rt + anti-ly-6g 抗体= 2.42 ±0.62% vs. 20.12 ±3.92%，p<0.01）。为了更好地了解cd8 + t 细胞浸润肿瘤部位的功能状态，我们测量了cd8+ t 细胞内部和表面上ifn-γ、cd28 和 pd-1 的表达。局部 rt 显着降低了 cd8 +t 细胞分泌 ifn-γ的比例，从33.06 4.53%降至13.25 2.08%，并增加了表达 pd-1 的 cd8 + t 细胞的比例（ctrlvs. rt=253.20± 57.03 au vs. 538.80 ±98.76） au，p<0.05）。
cd28 表达未观察到显着变化。当抗ly-6g抗体被给予辐照小鼠时，ifn-γ分泌达到与未处理的 llc 小鼠相同的水平（29.74±3.55%），而与辐照小鼠进行比较抗ly-6g抗体处理后的pd-1 表达没有变化小鼠。因此，在这部分我们建议pmn-mdscs 通过抑制cd8 + t 细胞促进放疗后肿瘤的再生。pmn-mdscs 不仅抑制了tme 中 cd8 + t 细胞的数量，而且还抑制了其活性。
为了确定辐照诱导mdscs的抑制机制，我们进行了免疫组化染色及inos和arg1活性检测。肿瘤切片的免疫组化染色显示，局部rt增强了arg1的表达，但没有增强inos的表达。arg1活性测定表明，局部照射显著提高了arg1的活性，从0.400.15 u/l提高到3.78 0.39 u/l ((p<0.01)。相比之下，no荧光标记的inos活性检测显示，辐照和未处理的肿瘤组织样本的荧光强度相似。
pd-l1的表达是mdscs 的一种新型免疫抑制机制。然后我们询问pd-l1 上调是否是rt 后 mdscs 介导的免疫抑制的机制之一。通过流式细胞术分析辐照后mdsc 中 pd-l1 的表达。图4e 显示，与未处理组相比，受照射肿瘤的mdsc 中的pd-l1 表达在照射后不久显着增加（照射后第三天：ctrlvs. rt=443.9 ±175.3 au vs. 1328.0 ±324.3 au，p<0.05）.然而，此后pd-l1表达继续下降，局部照射组在照射后第3周显着低于未治疗组（ctrl vs. rt=1，465.0± 399.6 au vs. 407.5±164.8 au，p<0.05）。外周血中mdscs 的 pd-l1 表达与局部肿瘤部位的表达趋势相同。
以上数据表明arg1表达的上调是照射后pmn-mdscs抑制功能的合理机制。然而，不涉及 pd-l1 和 inos的调节。为了进一步证实这一假设，在辐射后通过灌胃给予arg1 抑制剂nor-noha。10 mg/kg/d nor-noha 有效地将arg1 活性从3.78 0.39 u/l 降低到2.02 0.25 u/l（p<0.01）。
rt后给予nor-noha显着增加cd8+t细胞比例（rt vs. rt+nor-noha=2.420.62% vs. 6.14 0.64， p<0.01），并伴有肿瘤再生延迟。inos抑制剂1400w 对肿瘤再生长没有影响。
我们的结果表明，rt通过上调肿瘤内pmn-mdsc 的百分比和arg1 活性来促进肿瘤免疫逃避。推测抑制pmn-mdscs 及其arg1 活性可能是一种新的抗肿瘤策略是合理的。越来越多的证据表明，pde5 抑制剂可以抑制tb 小鼠和癌症患者mdsc 中 inos和 arg1 的活性和表达。因此，通过灌胃给予西地那非20 mg/kg/d，以研究它是否可以促进rt 的抗肿瘤作用并阐明潜在机制。如图5b 所示，正如我们预期的那样，西地那非延迟了照射后的肿瘤再生长，这与阳性对照nor-noha 相当。tme 的免疫特征表明，当给予西地那非时，肿瘤内pmn-mdsc 的比例从38.66±4.24%下降到23.57±2.38%。
此外，西地那非也显着降低了arg1 的表达。为了进一步检查西地那非对mdsc 的抑制是否真的导致抗肿瘤免疫增强，我们分析了肿瘤内cd8 + t 细胞的比例和活性。流式细胞术分析表明cd8 + t 细胞的百分比从2.42 ± 0.62%增加到7.21 ± 1.22%。
此外，当给予西地那非时，cd8 + t 细胞分泌的ifn-γ也显着升高。因此，我们证实pde5 抑制剂西地那非通过调节pmn-mdscs 改善了照射后肿瘤免疫微环境。西地那非联合放疗可能是提高放疗疗效的一种有前景的策略。
工作揭示了pmn-mdscs中arg1通路介导rt后肿瘤再生的新机制，如图6所示。我们认为，pmn-mdscs是辐照招募的主要亚型，而不是m-mdscs。在广泛的免疫抑制机制中，arg1的上调和激活是pmn-mdscs在放疗后抑制cd8+t细胞的主要机制。为了克服pmn-mdscs引起的免疫抑制，我们提出并证明，sildenafil和rt联合使用降低了pmn-mdscs在tme内的募集和免疫抑制作用，激活了cd8+ t细胞应答，导致肿瘤生长延迟。综上所述，我们的研究结果为缓解免疫抑制tme以提高rt治疗效果提供了一种新的解决方案。虽然所有这些结果都是在llc小鼠模型中进行的，但同样的机制是否适用于其他肿瘤模型尚不清楚。此外，在不同的辐射方案下，mdscs及其亚型如何影响tme仍未确定。因此，这些问题还需要进一步的研究来解决。
